王水英语
麦克劳。埃万格洛，马蒂亚斯贝尔，安德烈亚斯沙？呃
德国亚琛工业大学生物研究所，邮编:1，52056
2005年2月收到1；2005年8月23日收到修订版；2005年8月24日接受2005年12月6日在线提供
摘要:
植物修复是利用植物提取土壤和地下水中的污染物，是一种很有前途的净化重金属污染土壤的方法。但是，它的使用受到许多因素的限制，例如植物生长所需的时间、营养供应以及金属摄入的限制。合成螯合剂已被证明能促进重金属的提取，但同时也暴露出一些负面影响。本研究的目的是探索三种天然低分子量有机酸(NLMWOA)(柠檬酸、草酸和酒石酸)作为合成螯合剂的替代品的作用。实验包括泥浆实验、毒性实验和系列实验。在植物提取实验中，将三种低分子量有机酸分别加入到受铜和铅污染的土壤中。与EDTA处理组(42 mgkg-1)相比，只有柠檬酸处理组铜摄入量显著增加。低分子量的有机酸没有显示出促进从植物中提取铅。对这一结果的可能解释是低分子量有机酸的降解速率。对于流动性和生物有效性较低的重金属如铅，这个比例可能过高。添加到土壤中的低分子量有机酸含量很高(62.5 mmol·kg-1土壤)但作用很小。在这方面，EDTA的用量很少(0.125 mmol。kg -1+0)更有效。因此，低分子量有机酸不适合增强植物对土壤中重金属的提取。
关键词:重金属有机酸螯合剂烟草植物修复
介绍
植物修复被定义为使用绿色植物从环境中去除污染物或使其无害化(Raskin等人，1997)。植物修复不仅可用于去除有机污染物，也可用于去除无机污染物。与填充、固定、淋溶等其他处理技术相比，既经济又不会对土壤基质造成不良影响。尽量减少对环境的干扰。这些网站通常都很漂亮，所以更容易被大众接受。比如德国莱比锡的植物修复基地，就受到了附近居民的好评。
虽然所有植物都有从土壤中提取金属物质的潜力，但一些植物已经显示出提取、积累和耐受高水平重金属的能力。根据植物界广泛的分类方法，这种植物被称为超积累植物。金属超积累是植物适应金属土壤生理生态的结果。超积累植物在生物修复中的潜力有限，即生长缓慢，生物量小。这些特征正好与Robinson等人(2000)的提议相反，即用于植物修复的植物应该生长迅速，扎根深，容易积累目标金属。根据(Ro mkens等人(2002年))，这种植物还应该具有高生物量。综合这些因素，烟草，一种来自南美和拉丁美洲的烟草，适合于植物修复。
螯合剂已被证明能够促进植物对重金属污染土壤的修复，这可以平衡高度富集的植物。虽然合成螯合剂如EDTA对重金属污染土壤的植物修复有积极作用，但其应用也存在一些缺点。EDTA对提取金属物质没有选择性(Barona等，2001)，生物降解性低(Wasay等，1998)。即使在很低的浓度下，它也会严重影响植物的生长(Chen and Cutright.2001)。在天然存在的螯合系统中发现的合成螯合剂的替代品被称为生物螯合剂。生物螯合剂，如腐殖酸，已被证明对重金属污染土壤的植物修复有积极的影响(埃万格洛等人，2004年)。另一种可能的选择是低分子量有机酸(NLMWOA ),它们被植物沥滤到土壤中。
我们知道植物根部渗出的有机化合物可能会间接或直接影响原有的溶解性和有毒离子。间接影响是通过影响微生物活动、根际土壤的物理性质和根系生长动态来实现的。直接影响是通过根际土壤的酸化、螯合、沉淀和氧化还原反应实现的(Uren和reise nauer 1998；Marschner等人1995).在这些化合物中，NLMWOA因其综合性能特别重要，对重金属的溶解性有重要作用(Mench和Martin，1991；克里希那穆提等人，1997；Nigam等人，2000年).和矿物营养(张等，1989；Jones等，1996)甚至比土壤PH值更重要(黄等，1998)。
本研究的目的是探索在实验室条件下，低分子量有机酸如何通过使用烟草来增强植物提取铜和铅污染土壤的能力。我们使用低分子量有机酸代替EDTA或其他合成螯合剂作为重金属污染土壤植物修复的促进剂，并评估其潜力。
2.材料和方法
2.1土壤描述
这是一种粉质、壤土状的砂质农业土壤，取自美国农业部(土壤调查手册，1995)在德国亚琛的Melaten农田0-30cm表层土。在室温下风干土壤样品，通过2mm的筛子研磨，并进行以下定性分析。用比重计(Bouyoucous，1952)测定土壤样品中的砂、粘粒和粉粒含量。有机质含量采用Walkley black法测定(Nelson和Sommers，1996)。通过氯化钙方法(Lewandowski等人，1997)确定pH值。土壤中总铅和铜的初始含量用王水消解，过滤后用火焰原子吸收光谱法测定。原子吸收光谱的校准标准是通过分别增加提取液中铜和铅的量来实现的。土壤理化性质见表1。
2.2盆栽实验
2.2.1土样制备
3 ~ 4月在温室内进行盆栽试验。将400克筛选过的土壤样品放入一个塑料桶中，桶底有六个小孔。塑料桶事先用稀硝酸清洗，以去除可能吸附在上面的任何金属。在每个盆下放一个盆和盘子。在每盆中加入以下肥料:674.4mg Ca(NO3)2·4h2o，175.6 mg KH2PO4，使它们的浓度分别在200-100mg kg-1之间。
表1所用土壤的重金属浓度和其他特性
参数内容
PH 6.8
有机物(%) 3.5
土壤粒级砂(%) 49.4
粘土(%) 42.1
淤泥(%) 8.5
铜(毫克千克-1) 21.8
铅(毫克千克-1) 48.7
2.2.2育苗和植物生长
盆栽试验中使用的植物是烟草。这种选择是基于这种植物可以在短时间内产生相对大量的生物量。种子在泥煤和沙子的混合物中发芽。3周后，将具有相似生物量的幼苗用于盆栽实验。所有烟草在受控的环境条件下生长，每天光照时间为65，438±0.6小时，光照和黑暗中的温度分别为25℃和20℃，相对湿度为60% (WalchLiu等，2000)。
2.2.3.有毒盆栽实验
实验包括对照处理组(不加螯合剂)，实验组低分子量有机酸含量为62.5、125和250 mmol·kg-1，EDTA浓度为250 mmol·kg-1。在添加螯合剂的当天，将具有相似生物量的幼苗移植到含有这种金属和低分子量有机酸的混合土壤的盆中。每盆种一粒种子，然后实验才真正开始。实验分三组同时进行。植物的干重显示了毒性效应。
2.2.4.植物提取盆栽试验
实验包括对照组(无重金属)和实验组。在实验组中，加入氯化铜和硝酸铅，使铜含量分别为225和450mg·kg-1，铅含量分别为300和600mg·kg-1。每个处理重复三次。当天加入铜、铅、肥料、62.5mmolkg-1NLMWOA和0.125 mmol kg-1 EDTA，然后每盆移栽一株。之后，实验开始了。所有移植的幼苗都有相似的生物量需求。为了避免土壤中家畜的铜和铅，灌溉用的蒸馏水不能直接淋在土壤表面，必须倒在盆下的盘子上。
2.2.5.植物收获和分析
实验中的植物在生长约3周后收获。收割时，植物的地上部分被切成短节，茎叶分开。下一步如琼斯和凯斯(1990)所述。用去离子水短暂冲洗植物样品(茎和叶)，用吸水纸干燥以除去表面污垢，然后在70℃干燥至恒重。称取样品，在接地球磨机中研磨成粒度均匀的颗粒。
研磨后称取约200mg干燥植物组织，放入规格为15ml的瓷坩埚中。在马弗炉中于500℃灰化5h并冷却。在60℃下，加入2ml盐酸并蒸发。在室温下，再次加入2ml的15%盐酸，用玻璃棒将灰分沥干，然后用定量滤纸(595，Schleicher和Schuell过滤器，孔径4LM)过滤。用去离子水将滤液调节至20ml，用AAS测定铜和铅的含量。
2.3.泥浆实验
向聚丙烯离心管中加入1g农业土壤，并预先用稀硝酸清洗离心管，以去除任何吸附的金属。将土壤用浓度为62.5mM的15ml溶液，即柠檬酸、草酸、酒石酸或0.125mM EDTA制成悬浮液。用1M氢氧化钠(9、7和5)将每种悬浮液调节至不同的PH值。离心管以70rpm摇动65438±08小时，然后离心65438±00分钟至65438±04g。用定量滤纸(595，Schleicher和Schuell过滤器，孔径4lm)过滤每个样品。为了保存样品，向每个样品中添加100ml 65%的硝酸。用原子吸收光谱法测定铜和铅的含量。每个处理重复三次。
2.4.柱状实验
本研究使用的玻璃管内径为24mm，长度为140 mm，玻璃管事先用稀硝酸清洗，以防止任何吸附的金属物质残留。装土:将25g含450mgkg-1氯化铜和600mgkg-1硝酸铅的土装入玻璃管中。实验前，土壤已沉降3个月，加入大量低浓度的溶解氯化铜和硝酸铅，使其均匀分布在土壤中。玻璃管的孔容为56%，相当于14ml。积水保持在土壤上方6厘米，在家禽羽化过程中保持这一水位。流出物流量保持在每小时的平均孔体积(14+-1mlh-1)。每个玻璃管分别用60-100 ml的62.5 mm柠檬酸、酒石酸、草酸、0.125mm乙二胺四乙酸或10mM氯化钙溶液洗脱。溶液液位根据渗滤液流量略有不同。在玻璃管底部，按14等份收集浸出液，并在当天进行测定。为了避免pH耐受效应，用1M氢氧化钠溶液将螯合剂溶液的pH值调至6.8，即土壤pH值。10mM氯化钙的离子强度与天然土壤相当(舒曼，1990)。氯化钙被用作对照和植物提取实验的对照。每个方案有五个实验。用原子吸收光谱法测定铜和铅的含量。
2.5统计分析
除了五个平行实验之外，每种铜和铅以及每种螯合剂的浓度被设定为三个平行实验。具体方法间的差异用t检验确定(P
3.结果
3.1.有毒盆栽实验
地上部分的干物质产量(叶和茎的总和)如图1所示。低分子量有机酸浓度为62.5 mmol·kg-1时，不会对植物干重产生负面影响，但螯合剂浓度较高时，干重小、黄化等中毒症状明显。柠檬酸在125 mmol·kg-1浓度下显著(P
3.2.植物提取盆栽试验
图2表明，随着土壤中铜和铅浓度的增加，花蕾中铜和铅的浓度也相应增加。柠檬酸促进了芽对铜和铅的吸收。62.5mmolkg-1柠檬酸处理组芽中铜的浓度明显高于对照组和其他低分子量有机酸及EDTA处理组。随着柠檬酸的加入，芽中的铜浓度达到67mgkg-1。草酸和EDTA对植物吸收铜的影响不那么显著，但高于对照组和酒石酸组。酒石酸对植物吸收铜没有增强作用。对于铅，只有EDTA表现出增强作用，芽中铅的含量约为63mg kg-1；+0;低分子量有机酸不显著(P
3.3.pH值的变化
植物提取实验的初始和最终PH值见表2。实验开始时，对照组土壤的pH值比原来的pH值低了0.3，这可能是由于添加了肥料。铜和铅的加入进一步降低了pH值。实验结束时，对照组的土壤恢复到原来的pH值。EDTA组的pH值变化与对照组相似。在实验开始时，低分子量有机酸的加入使pH值降低到平均5.6，在实验结束时，pH值达到平均约7.7，比土壤的原始PH值高0.9。
3.4.泥浆实验
表1显示了自然污染土壤中铜和铅的百分含量，分别为265，438+0.8和48.7.7 mgkg-65，438+0。低分子量有机酸影响下的铜含量明显高于EDTA。不同低分子量有机酸影响的含量数量级是相同的。与初始浓度相比，低分子量有机酸迁移了约20%至25%的铜和约8%的铅。虽然低分子量有机酸和EDTA在移动铜的能力上有很大差异，但移动的铅的量具有相同的数量级。只有pH值为5时，柠檬酸动员能力突出，为36%。1%的铜和0.5%的铅被孔隙水(对照组)所动员。
3.5.系列实验
表4显示了在一系列实验中，从用450mgkg-1铜和600mgkg-1铅处理的土壤中迁移的铅和铜的百分比。低分子量有机酸对铜的活化作用明显高于EDTA。EDTA比氯化钙多0.4%左右，但两者的平均水平是同一个数量级。与低分子量有机酸相比，氯化钙作为对照组和EDTA对铜的活化量可以忽略不计。柠檬酸在第一部分被调动最多，约25%。转移量随着孔体积的数量而减少。草酸和酒石酸的体积迁移在第四孔达到最大值。但分别只有9%和3%左右。由低分子量有机酸、EDTA和氯化钙动员的量是相同的数量级，在0.5%和2%之间。比较草酸、酒石酸和柠檬酸，铅和铜的萃取曲线不同。铅浸出曲线的第二孔隙体积达到最大值。
讨论
植物毒性实验表明，低分子量有机酸和EDTA对植物的毒性是不同的。Chen和Cutright (2001)报告称，当土壤中EDTA的浓度为1.25mmolkg-1时，EDTA表现出高毒性(图1 B)并降低植物生长。EDTA浓度为0.1.25 mmol·kg-1时，植株无中毒迹象，平行植株间差异较小。当浓度为0.25mmolkg-1时，植株干重与对照相似。然而，标准偏差非常高，因此选择较低浓度的添加剂进行植物提取实验(如表1 B所示)。添加62.5毫摩尔kg至1范围内的低分子量有机酸对植物芽的干重产量没有不利影响，甚至略微增加了植物芽的产量(见表1A)。因此，选择该浓度作为植物提取实验。低分子量有机酸浓度较高导致生物量减少，可能是控制溶质吸收的生理系统受损所致(Vassil et al .，1998)。低分子量有机酸可能破坏质膜(Pasternak，65438 Zn2+0987；Kaszuba和Hunt，1990)，而土壤溶液中的随机金属络合物可以通过蒸腾流到达根的木质部和芽(Vassil等人，1998)。铜和铅的毒性试验在有机酸的毒性试验之前进行。在含有450mgkg-1铜和600mgkg-1铅的土壤中，这些对植物体内的铜和铅没有明显的危害。
影响(未列出数据)。植物材料分析表明，62.5mmolkg-1柠檬酸和0.125mmolkg-1 EDTA处理的土壤芽中铜含量显著高于对照组(P < 0.05)，分别增加了2.3倍和1.1倍(见图2)。根据Schmidt (2003)和Gramss等人(2004)的研究，铜和铅的增加并不多。虽然草酸表现出与柠檬酸相同的动员潜力，但它并没有在所有pH值下增加芽中的铜浓度(见图3)(见图2)。草酸使芽中铜浓度的增加量相当于EDTA的量级。植物分析表明，低分子量有机酸不促进植物对铅的吸收。尽管低分子量有机酸的实验组在泥浆(见图3b)和柱实验(见图4b)中显示出比EDTA更高的移动性。EDTA处理组显示植物芽中的铅浓度增加了约三倍(见图2)。但仍低于Grcman等人(2001)描述的水平。在植物提取实验中，土壤中低分子量有机酸的浓度比EDTA高250倍，但作用微乎其微，即使在含铜的土壤中也是如此。在植物提取的实验中，EDTA在这个剂量下仍然不起作用。EDTA只有在毒性明显，淋失量超过植物吸收量时才有效。
在泥浆实验中，62.5mM低分子量有机酸比0.125mM EDTA具有更强的动员能力。然而，与EDTA相比，低分子量有机酸对铅显示出很小的迁移能力(见图3b)。在pH 5时，只有柠檬酸(图3b)比EDTA、草酸和酒石酸移动更多的铅。原因之一可能是低pH值和盐迁移相结合导致pH调节，会导致较高的重金属迁移。铜的溶解度随着PH值的降低而增加(Schmidt，2003)。这个独立的实验重复了很多次，结果都是一样的。该系列实验强调了低分子量有机酸对铜和铅的浸出能力的巨大差异，以及低分子量有机酸的络合能力的差异。被低分子量有机酸移动的铅量非常少(见图4)。这证明只有EDTA能增加植物提取液对铅的吸收。低分子量有机酸迁移铜的能力，尤其是柠檬酸，比EDTA更明显(P
关于系列实验中低分子量有机酸的潜力，结合加标土壤在植物提取实验中没有经过普通的干湿循环(两个月)，吸收肯定是加强了。这说明这项技术在野外很可能会失败。这种方法缺乏高效率可能是由于低分子量有机酸的生物降解。这将受到pH值增加的影响，具体来说，羧酸中的H+将被消耗，OH-1和CO2将被释放(Gramss等人，2004年)。这导致络合剂的损失和pH值的升高，进一步降低了铜和铅的生物有效性。铜比铅更容易在土壤中迁移，所以它是在有机酸降解之前从植物中提取的。为了说明这项技术无效，先排除不能进入植物的可能性。因为在EDTA的情况下(Grcman et al .，2001)，它们的复合物通过木质部从根运输到芽(Senden et al .，1990；郭，1995).如果在植物收获前几天加入低分子量有机酸，该技术的效率将会提高。然而，考虑到在每罐中加入约6g柠檬酸会使这种方法相当昂贵，这个想法也被放弃了。此外，生物对金属的生物有效性与土壤的pH值有关(Schmidt，2003)，添加低分子量有机酸后土壤的最终pH值约为7.7，会降低铜和铅的生物有效性。因此，连续添加低分子量有机酸将带来长达数年的清洗，这是不可取的。然而，作为低分子量有机酸的替代物，可以使用其它可生物降解的螯合剂，例如硝基三乙酸(NTA)和[s，s]-乙二胺二琥珀酸(edds)。与低分子量有机酸相比，NTA是一种非常强的螯合剂。(Elliot和Denneny，1982)，但仅是对照组的2.5倍，不足以进行植物修复(Kulli等人，1999)。EDDS是从侧柏(Nishikiori等人，1984)中提取的天然物质。它已显示出用于植物提取的潜力，但Grcman等人(2003年)所能达到的浓度仍远未达到有效植物修复所需的浓度。
5.结论
低分子量有机酸，尤其是柠檬酸，对铜的生物利用率有积极作用，使其吸收提高2.3倍。另外，EDTA的危害也不会有负面影响。比如低浓度土壤下芽的生物量严重减少。然而，不仅低分子量有机酸在铅的植物修复中是低效的，而且在任何影响发生之前加入大量低分子量有机酸。EDTA在这方面效率更高。低效率可能是由低分子量有机酸的生物降解引起的。它们降解得太快，不能达到预期的效果。因此，低分子量有机酸不适合强化植物修复。并且作为螯合剂的替代品不是经济的选择。我们将寻找其他天然螯合剂来代替合成螯合剂，以达到我们的研究目的。
表示感谢/感激
我们要感谢技术助理在研究过程中提供的技术帮助，还要感谢Ingolf Schuphan、Rongji、Philippe Corvini和Shelley Obermann的大力支持。